Forschung

Degenerative Prozesse in biologischen Systemen, wie etwa programmierter Zelltod (z.B. Apoptose) und Altern, sind wichtige Arbeitsschwerpunkte der Entwicklungsbiologie. Das Verständnis der Grundlagen dieser komplexen Prozesse ist von großer Bedeutung und hat bedeutende Konsequenzen. So ist beim Menschen ein fortgeschrittenes Alter der wichtigste Risikofaktor zur Ausprägung verschiedener leichterer Funktionsstörungen bis hin zu schwersten Erkrankungen (z.B. Alzheimer und Parkinsonerkrankung, verschiedene Formen von Krebs). Für die Entwicklung effizienter Strategien gegen diese Erkrankungen ist das Verständnis der molekularen Grundlagen biologischen Alterns eine ganz entscheidende Voraussetzung. Solche Interventionen sollen dazu dienen, die Qualität des Lebens auch in fortgeschrittenem Alter zu verbessern. In einer „ergrauenden“ Welt mit immer größeren Zahlen älterer Menschen kommt der Alternsforschung eine immer wichtigere Funktion zu.

Da Altern auf ein sehr komplexes Netzwerk verschiedener zellulärer Stoffwechselwege und Interaktionen zurückgeht, sind in der experimentellen Alternsforschung Untersuchungen nicht ausschließlich auf den Menschen beschränkt, sondern erfolgen an einer Reihe verschiedener Modellsysteme. Modellsysteme wie Hefen, filamentöse Pilze, Fliegen, Würmer oder aber auch Zellkulturen sind von geringerer Komplexität als Säugetiere. Der Vergleich der Daten, die auf die Untersuchung dieser verschiedenen Systeme zurückgehen, bietet die größte Chance, die basalen Mechanismen degenerativer Prozesse biologischer Systeme allgemein zu erarbeiten. Die Gruppe Molekulare Entwicklungsbiologie von Herrn Prof. Osiewacz arbeitet an folgenden Schwerpunkten:

Mitochondriale Qualitätskontrolle
  Oxidativer Stress, Mitochondrielle Dynamik, Proteostase, Mitophagie
Rolle des programmierten Zelltods bei degenerativen Entwicklungsprozessen des Hyphenpilzes Podospora anserina
Molekulare Mechanismen der Kupferhomöostase


Förderung 

Die experimentellen Arbeiten werden durch Mittel des Landes Hessen ( LOEWE IPFLOEWE Ub-Net, ATG71), Sachmittel der Deutschen Forschungsgemeinschaft (Bonn, Bad-Godesberg, Deutschland ) im Rahmen von Einzelförderungsprojekten und im 'Cluster of Excellence - Macromolecular Complexes' gefördert.

   

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MITOCHONDRIALE QUALITÄTSKONTROLLE

Die in diesem Bereich angesiedelten Projekte verfolgen die Erforschung grundlegender Mechanismen der mitochondrialen Qualitätskontrolle. Mitochondrien dienen als „Kraftwerke der Zelle“ und sind neben der Energiebereitstellung in Form von ATP auch für die Synthese von Aminosäuren, die Herstellung von Eisen/Schwefel-Clustern und die Fettverbrennung verantwortlich. Jedoch sind Mitochondrien auch die Hauptquelle für reaktive Sauerstoffspezies (ROS), die durch eine fehlerhafte Elektronenübertragung innerhalb der Atmungskette entstehen und durch ein Netzwerk verschiedenster Reaktionen miteinander verbunden sind (Hydroxylradikale, Superoxid und Wasserstoffperoxid). In geringen Konzentrationen dienen ROS als Signalmoleküle, in höheren Konzentrationen führen sie hingegen zu Schäden der zellulären Bestandteile (DNA, Lipide und Proteine). Durch die Akkumulation der Zellschäden und die daraus resultierenden Beeinträchtigungen für die Zelle werden ROS für den altersabhängigen Funktionsverlust der zellulären Komponenten verantwortlich gemacht. Zum Schutz vor ROS existieren verschiedene Mechanismen, die nicht nur aufeinander folgend, sondern auch parallel aktiv sind.

In (a) ist eine wachsende Kultur von Podospora anserina (links) neben einer Kultur im seneszenten Stadium (rechts) abgebildet. In (b) sind zwei Zeitpunkte einer 4D-Mikroskopieaufnahme gezeigt. Mitochondrial lokalisiertes GFP wurde zur räumlichen und zeitlichen Beobachtung der mitochondrialen Dynamik verwendet. 
Die Aufnahmen entstanden an einem CLSM mit „Spinning-Disk“-Modul. Rot markiert ist ein Bereich der Mitochondrien, der von Zeitpunkt t 0 zu t 1 eine Fusion zeigt. In (c) ist ein schematischer Querschnitt durch ein Mitochondrium dargestellt. Neben der Entgiftung von ROS durch SOD3 und dem Auflösen von Proteinaggregaten durch Chaperone wird auch der Abbau von geschädigten Proteinen durch Proteasen gezeigt.

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Oxidativer Stress und ROS-Entgiftung („ROS-Scavenging“)

Um die Schädigung der Mitochondrien durch ROS (oxidativer Stress) möglichst gering zu halten, existieren in P. anserina spezielle Enzyme. Ein Schwerpunkt des Arbeitskreises liegt hierbei auf den Superoxid Dismutasen (PaSOD1/2/3) und dem Peroxiredoxin (PaPRX1). Bei bisherigen Untersuchungen an Deletions- und Überexpressionsstämmen dieser Gene zeigten sich neben veränderten Wuchsraten und Sporulationsdefekten auch veränderte Lebensspannen [Zintel et al. (2010) Exp Gerontol 45: 525-532]. Im Rahmen des vom BMBF geförderten Verbundprojektes „GerontoMitoSys“ wird in einem systembiologischen Ansatz in Zusammenarbeit mit Mathematikern und Modellierern ein Computermodell erstellt, das den Zusammenhang zwischen ROS-Entgiftung und der mitochondrialen Proteinqualitätskontrolle mathematisch beschreibt.

Proteostase

ROS können an Proteinen Schäden verursachen. Ein Teil der oxidativ geschädigten Proteine kann gezielt durch die Reduktion spezifischer oxidativer Modifikationen, z.B. durch die Reduktion von oxidiertem Methionin mittels der Methionin-Sulfoxid-Reduktasen, repariert werden. Ebenso sind verschiedene Chaperone, welche in der Lage sind, die korrekte Neufaltung fehlgefalteter Proteine zu unterstützen und Proteinaggregate aufzulösen, an der Qualitätskontrolle mitochondrialer Proteine beteiligt.

Allerdings müssen viele der geschädigten Proteine endgültig abgebaut werden. Die Degradation terminal geschädigter mitochondrialer Proteine wird durch eine Vielzahl von Proteasen bewerkstelligt, die im Intermembranraum, der inneren Membran und der Matrix der Mitochondrien lokalisiert sind. Neben dem Abbau von Schäden werden die mitochondrialen Proteasen auch für die Reifung und Prozessierung verschiedener Substrate und den Wiederaufbau geschädigter Strukturen benötigt. Die PaIAP- und die PaMAP- Protease, beide in der inneren Membran lokalisiert, bauen nicht nur schadhafte Untereinheiten der Atmungsketten-Komplexe ab, sondern sind gleichzeitig auch essentiell für die Assemblierung der Komplexe und die Aufrechterhaltung der korrekten Stöchiometrie der Untereinheiten [Weil et al. (2011) Cell Cycle 10: 4280-4290, Luce & Osiewacz (2009) Nat Cell Biol 11: 852-858]. Der Abbau geschädigter Proteine der mitochondrialen Matrix wird durch die beiden AAA+-Serinproteasen PaLON und PaCLPXP katalysiert. Von der CLPXP-Protease nimmt man an, dass sie für die Generierung des Stresssignals der UPR mt verantwortlich ist, während für die PaLON-Protease gezeigt werden konnte, dass sie neben der Qualitätskontrolle von Proteinen auch für die Regulation der mtDNA-Stabilität wichtig ist.

Mitochondriale Dynamik

Eine weitere Ebene der Qualitätskontrolle ergibt sich durch die ständige Fusion und Teilung von Mitochondrien innerhalb eines komplexen dynamischen Netzwerks. Hierzu werden zwei pilzliche Modellorganismen untersucht: P. anserina und S. cerevisiae . Durch das Fusionieren und Teilen der einzelnen Mitochondrienabschnitte kommt es zu einer konstanten Durchmischung mitochondrialer Bestandteile (mtDNA, Proteine und Lipide). Auf diese Weise können mitochondriale Schäden durch Einbringen intakter Komponenten ausgeglichen werden. Eine zentrale Rolle im hiermit verbundenen Projekt bilden die Fusions- und Teilungskomponenten Mgm1 und Dnm1. Eine Deletion der jeweiligen Komponenten erlaubt die Untersuchung der Auswirkungen auf mitochondriale Dynamik und der damit verbundenen Konsequenzen sowohl für die Proteinqualitätskontrolle, Lebensspanne als auch für andere zelluläre Mechanismen [siehe: Scheckhuber et al. (2007) Nat Cell Biol 9: 99-105].

Mitophagie

Sind einzelne Abschnitte des mitochondrialen Netzwerks so stark geschädigt, dass eine Fusion mit dem Netzwerk zu keiner Reparatur oder sogar zu einer Verbreitung von Schäden führen würde, können diese Abschnitte nicht mehr mit dem Netzwerk fusionieren. Solche defekten Mitochondrien werden über Mitophagie (spezielle Form der Autophagie) abgebaut. Im Rahmen des GerontoMitoSys-Projektes wird die Rolle der Autophagie und im speziellen Mitophagie in P. anserina und S. cerevisiae v. a. in Hinblick auf die Lebensspanne untersucht.

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Rolle des programmierten Zelltods bei degenerativen Entwicklungsprozessen des HyphenpilzesPodospora anserina

Untersuchungen der letzten ca. 30 Jahre belegen, dass den Mitochondrien bei P. anserina eine ganz wesentliche Rolle bei der Alterung zukommt. Dabei konnte frühzeitig gezeigt werden, dass während der Alterung defekte Moleküle der mitochondrialen DNA (mtDNA) akkumulieren und es zu Fehlfunktionen der Mitochondrien kommt.

Kreuzung zweier sensitiver Stämme (A: s x s) und zwischen einem  „Killer“- Stamm und einem sensitiven Stamm (B: Us4 x O). Der Pfeil in A zeigt auf einen normalen viersporigen Ascus, der Pfeil in B auf einen zweisporigen Ascus, der als Ergebnis von „spore killing“ entstanden ist.



Aus der Apoptose-Forschung in Säugersystemen ist bekannt, dass die Mitochondrien beim Auslösen des programmierten Zelltods eine zentrale Rolle spielen. Eine Reihe von Proteinen, von denen Homologe auch im Genom von P. anserina kodiert sind, spielen bei der Regulation dieses Prozesses eine wichtige Rolle. Damit stellt sich die Frage, ob bei P. anserina nicht auch apoptotische Prozesse, etwa beim Absterben der Hyphenspitzen am Ende der Lebensspanne, wirksam sind. Verschiedene experimentelle Ansätze gehen dieser Fragestellung nach.


Zurzeit werden diese Projekte in dem von der DFG geförderten Projekt „Die Rolle des programmierten Zelltods bei degenerativen Entwicklungsprozessen des Hyphenpilzes Podospora anserina“ untersucht.

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Molekulare Mechanismen der Kupferhomöostase

In biologischen Systemen stellt Kupfer als Co-Faktor diverser Enzyme (z.B. Cu/Zn-Superoxid-Dismutase, Cytochrom Oxidase) ein essenzielles Spurenelement dar. Die Eigenschaft, Elektronen sowohl leicht aufnehmen (Cu2+ -› Cu+) als auch abgeben (Cu+ -› Cu2+) zu können, macht dieses Metall zu einem idealen Co-Faktor für die Katalyse von Redoxreaktionen. Aufgrund dieser Eigenschaft ist Kupfer aber auch sehr gefährlich, denn durch die Übertragung von Elektronen auf Sauerstoff können eine Reihe reaktiver Sauerstoffspezies (ROS = ‚reactive oxygen species') entstehen, vor allem das hochgiftige Hydroxyradikal (OH· – „Fenton Reaktion“). Um dies zu verhindern, wird Kupfer in der Zelle effektiv an Proteine gebunden und seine Aufnahme und Weitergabe streng reguliert. Zumindest in Hefe liegt offenbar weniger als ein freies Kupferatom pro Zelle vor.

Ein Zusammenhang zwischen zellulärer Verfügbarkeit von Kupfer und Alterung in Podospora anserina wurde durch die Charakterisierung der langlebigen Mutante grisea deutlich: Dieser Mutante, die eine um 60% verlängerte Lebensspanne zeigt, fehlt aufgrund einer Mutation im Grisea Gen der Transkriptionsfaktor GRISEA. Eines der Zielgene dieses Transkriptionsfaktors ist das für den Hochaffinitäts-Kupfertransporter PaCTR3 kodierende PaCtr3 Gen. PaCTR3 steht in der grisea Mutante damit nicht zur Verfügung, was zu einem globalen zellulären Kupfermangel führt.

Als Folge ist die Aktivität der Cytochrom-C-Oxidase eingeschränkt. Für den obligaten Aerobier P. anserina ist das Fehlen der COX nicht letal, da er – ähnlich wie auch höhere Pflanzen - eine alternative Oxidase (AOX) induzieren kann. Atmung via AOX liefert weniger ATP, es werden aber auch weniger reaktive Sauerstoffspezies (ROS) gebildet (Gredilla et al, Manuskript eingereicht). Dies wiederum hat zur Folge, dass in der Mutante grisea ROS induzierte zelluläre Schädigungen vermindert auftreten: eine mögliche Ursache für die Lebensverlängerung der Mutante grisea. Wird experimentell gezielt die Versorgung zur COX mit Kupfer unterbrochen, kommt es ebenfalls zu einer Verlängerung der Lebensspanne (Stumpferl et al. 2004).

Der Schwerpunkt der Untersuchungen im Arbeitskreis liegt auf zwei Teilaspekten des Kupfermetabolismus: Zum einen sollen die beteiligten Komponenten und molekularen Mechanismen des Transports von Kupfer zur COX geklärt und mit den Ergebnissen aus anderen Modellorganismen verglichen werden; zum anderen soll ein möglichst detailliertes Abbild der Verteilung von Kupfer innerhalb der Zelle und der Veränderung dieses Gleichgewichts im Verlaufe der Lebensspanne von P. anserina erarbeitet werden. Hier belegen eine Reihe in den letzten Jahren erhaltener Befunde, dass im Verlaufe der Alterung Veränderungen in der zellulären Lokalisation von Kupfer auftreten. Die Grundlagen dieser Vorgänge werden analysiert. Ein Hauptaugenmerk liegt dabei auf der Rolle der Mitochondrien als zellulärer Kupferspeicher.

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* Alle zitierten Arbeiten werden in der Publikationsliste des Arbeitskreises ausgewiesen.